Investigation on the Adhesion Mechanisms of Magnetic Composite Particles with the Centrifuge Method
Final Report Abstract
Eine Möglichkeit für die gezielte Trennung von spezifischen Proteinen aus einer Fermentationsbrühe stellt die Hochgradienten-Magnetseparation dar. Dabei kommen funktionalisierte Magnetpartikel zum Einsatz. Die Funktionalisierung ist auf das Produkt abgestimmt, sodass im Idealfall nur dieses an die Partikel bindet. Die Partikel können dadurch direkt in die Fermentationsbrühe mit dem Produkt hinzu gegeben werden. Dort bindet das Produkt an die Partikel. Im Anschluss erfolgt die Trennung der Partikel samt Produkt vom Rest der Fermentationsbrühe in einem Magnetscheider. Im Magnetscheider baut sich dabei ein Partikelhaufwerk auf, das im Anschluss an den Trennprozess resuspendiert werden muss, um die Partikel erneut einsetzen zu können. Bisherige Arbeiten beschäftigten sich zum Großteil mit der Betrachtung der Partikelabscheidung an der Magnetmatrix. Darauf aufbauend sollte untersucht werden, welche Kräfte notwendig sind, um das Partikelhaufwerk aufzulösen und um Einzelpartikel von der Magnetmatrix abzutrennen. Die Messung der Haftkräfte zwischen den Partikeln und der Magnetmatrix war nicht direkt möglich. Anstelle der Magnetmatrix kamen dafür ebene Haftpartner, sogenannte Substrate, verschiedener Materialen zum Einsatz. Zu untersuchen war die oftmals getroffene Annahme, dass außer der Magnetkraft alle anderen Kräfte vernachlässigbar sind. Für die Messung der Haftkraft zwischen den Partikeln und einem Substrat war die Zentrifugenmethode aus der Literatur bekannt. Der entsprechende Aufbau musste zunächst für die vorhandene Zentrifuge entwickelt und die Methode etabliert werden. Bei der Zentrifugenmethode werden die Partikel mit dem Substrat in Kontakt gebracht und anschließend einem Zentrifugalfeld ausgesetzt. Im Verlauf der Messungen wurden die Drehzahl und damit die Zentrifugalkraft schrittweise erhöht. Eine Kamera, die an ein Mikroskop angeschlossenen ist, nimmt Bilder des Substrats vor und nach jedem Zentrifugationsschritt auf. Durch einen Vergleich der Partikelanzahl vor und nach den einzelnen Zentrifugationsschritten ist die Haftkraftverteilung bestimmbar. Für die Messung der Partikel-Partikel-Haftkräte musste die Methode angepasst werden. Als charakteristische Größe für die Wechselwirkungen diente die Höhe des Partikelhaufwerks im Zentrifugalfeld, wobei die Zentrifugalkraft der Haftkraft entgegen wirkte. Die eingesetzte Zentrifuge ermöglichte die Aufnahme der Haufwerkshöhe. Bei dem Partikelhaufwerk handelt es sich um eine komplexe Kontaktsituation, in der unter anderen die van der Waals-Kraft, die Magnetkraft, hydropathische Wechselwirkungen als auch elektrostatische Effekte einen Anteil an der Gesamthaftkraft haben. Um einzelne Kraftkomponenten und deren Einflussfaktoren untersuchen zu können, erfolgte zunächst eine Reduktion der Komplexität auf definierte Partikel-Substrat-Kontakte. Im ersten Schritt fanden Messungen mit magnetisierbaren, sphärischen Partikeln mit sehr enger Partikelgrößenverteilung statt. Der Fokus lag dabei auf der van der Waals-Kraft. In der Tat konnten bereits bekannte Einflüsse, wie der Zusammenhang zwischen der Haftkraft und dem Partikelradius sowie der Rauheit bestätigt werden. Erfolgten die Messungen hingegen in einem Magnetfeld eines Permanentmagneten zeigte sich ein unerwartetes Verhalten. Der Anstieg der Haftkraft war größer als die aufgebrachte Magnetkraft. Verantwortlich sind elastische Deformationen innerhalb der Kontaktzone, durch die die van der Waals-Kräfte gestärkt werden. Im zweiten Schritt kamen acht Partikelsysteme zum Einsatz, die verschiedene Oberflächenfunktionalisierungen und damit Ladungsdichten aufwiesen. Vier Partikelsysteme hatten eine chemische Modifikation. Die übrigen vier Partikelsysteme hatten je eine Proteinart (Bovine Serum Albumin (BSA), Streptavidin, Avidin und Protein A) kovalent gebunden. Bei den Partikelsystemen mit Bovine Serum Albumin, Streptavidin und Protein A lagen die Haftkräfte oberhalb des Messbereichs. Der Messbereich ergibt sich aus der minimalen und der maximalen Drehzahl der Zentrifuge. Bei den übrigen fünf Systemen traten sehr starke elektrostatische Abstoßungen auf. Durch die Zugabe geringer Salzmengen (0,01 Mol/l) oder die Einstellung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt der Partikel konnte die elektrostatische Abstoßung jedoch unterbunden werden. Aufgrund der geringen notwendigen Salzkonzentration ist davon auszugehen, dass im Prozess ebenfalls keine Abstoßung auftritt. Das unterschiedliche Verhalten zeigt weiterhin, dass die Proteinart bzw. das Produkt einen Einfluss auf die Partikelhaftung hat. Für Partikel mit Avidin und mit BSA fanden zusätzlich Versuche zum Einfluss hydropathischer Wechselwirkungen statt. Die beiden Systeme wurden ausgewählt, da sie sich in den vorangegangenen Versuchen am meisten unterschieden. Für die Versuche wurden zum einen Glassubstrate hydrophobiert bzw. hydrophilisiert und zum anderen die Salzart entsprechend der Hofmeisterreihe variiert. Bei der Hydrophobizität des Substrats gibt es die Tendenz, dass die Partikel mit steigender Hydrophobizität stärker haften. Ein Einfluss der Salzart war bei der eingesetzten Konzentration von 0,1 Mol/l nicht feststellbar. Für die genauere Betrachtung der Partikel-Partikel-Wechselwirkung musste zuerst eine entsprechende Messmethode erarbeitet werden. Die Betrachtung von klar definierten Partikel-Partikel-Kontakten ist allerdings mit der Zentrifuge nicht möglich. Die eingesetzte Zentrifuge (LUMiSizer) verfügt über eine Optik, mit der eindimensional die Transmission messbar ist. Das ermöglicht es die Höhe eines Partikelhaufwerkes während der Zentrifugation zu messen. Bei den Partikeln ohne anhaftendes Protein lagen die Haftkräfte zwischen den Partikeln ohne Magnet unterhalb des Messbereichs. Befand sich jedoch Protein auf der Partikeloberfläche kam es teilweise zu einem starken Anstieg der Haftkraft. Die eingesetzte Laborzentrifuge machte den Einsatz eines externen Mikroskops für die Bildaufnahme bei der Partikel-Substrat-Haftkraftmessung notwendig. Bei den Messungen der Haftkräfte in einem Haufwerk gibt die Optik der Zentrifuge nur eindimensionale Daten. Um diese Nachteile zu beseitigen erfolgten parallel zu den Versuchen die Konstruktion und der Bau einer Zentrifuge mit einem integrierten Mikroskop. Durch den Einsatz eines mechanischen Bildkorrektors gelang es, das rotierende Bild in ein stationäres Bild um zu wandeln. Dadurch ist die rotierende Probe kontinuierlich mit einer festinstallierten Kamera aufnehmbar. Die minimale, praktische Auflösung liegt bei 10 µm. Die optische Vergrößerung beträgt circa 8,9.
Publications
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