Die Rückkopplung der IL-12p70 Antwort durch Ncf1 (p47phox) und seine Bedeutung in der Tumorprävention
Final Report Abstract
In dem Projekt sollte untersucht werden, ob die von uns entdeckte Regulation der IL-12p70 Antwort durch das NADPH Oxidase Protein p47phox in dendritischen Zellen auch einen Einfluss auf die Entstehung und das Wachstum von Tumoren hat. Darüber hinaus sollte der Mechanismus genauer untersucht werden und Ansätze für die gezielte Manipulation dieses Effektes in dendritischen Zellen entwickelt werden. Das Hauptziel, die Untersuchung der Rolle von p47phox hinsichtlich Tumorgenese konnten wir mit der Etablierung eines entzündungsvermittelten Tumormodells des Dickdarms (DSS/AOM Modell) erreichen. Interessanterweise haben wir in unseren Analysen jedoch nicht die Regulation von IL- 12p70 detektieren können, sondern eine entgegengesetzte Regulation (p47phox KO inhibiert IL-23 im Tumor) seines „Schwester“-Zytokins IL-23. Dies ist insbesondere von großem Interesse für uns, da IL-23 im Darm als tumorpromovierend gilt und eine Regulation durch p47phox eine neue Möglichkeit für gezielte Therapieansätze bieten könnte. Die Untersuchungen zum Mechanismus der p47phox-vermittelten IL-12p70 Regulation in dendritischen Zellen warf allerdings einige zunächst scheinbar unlösbare Probleme auf. Die verfügbaren Antikörper für Western Blot und Immunpräzipitation waren ungeeignet, da sie teilweise das Protein nicht detektierten, aber vor allem die native Form nicht erkannten. Damit waren sie für die IP nicht geeignet. Mittlerweile konnte dieses Problem durch die Bereitstellung einen selbst generierten Antikörpers durch einen Kooperationspartner gelöst werden. In Folgeuntersuchungen kann nun die Frage des Mechanismus geklärt werden. Wir haben eine umfangreiche Analyse von miRNAs, welche in TLR9-induzierten dendritischen Zellen aus WT und p47KO Mäusen durchgeführt. Die gefundenen, in ihrer Expression veränderten miRNAs sind an der Regulation von TLR und Zytokin Signalwegen beteiligt und bieten einen spannenden Ausgangspunkt für Folgeuntersuchungen. Um die Limitationen in Zellzahl, Verfügbarkeit, Stabilität und Reliabilität bei der Arbeit mit primären dendritischen Zellen zu umgehen, haben wir konditional immortalisierte myeloide dendritische Zelllinien generiert, die vergleichbare Eigenschaften wie Primärzellen aufweisen, sich darüber hinaus jedoch problemlos mit Genen oder interferierenden RNAs (z.B. shRNAs), verpackt in lentiviralen Partikeln, manipulieren lassen. Mit Hilfe der generierten Zellen, den Erkenntnissen auf dem Gebiet der Tumorgenese und der miRNA Analyse können weitere Untersuchungen durchgeführt und der Regulationsmechanismus von p47phox in dendritischen Zellen näher beleuchtet werden.
Publications
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Generation of Inducible Immortalized Dendritic Cells with Proper Immune Function In Vitro and In Vivo. 2013, 8(4).PLoS ONE
C. Richter, S. Thieme, J. Bandoła, M. Laugsch, K. Anastassiadis and S. Brenner
