Polypeptide dynamics and structure studied simultaneously by collision-induced fluorescence quenching and resonance energy transfer in the 10-Å domain
Final Report Abstract
Die Polypeptidkette hat ihre eigene physikalische Chemie, die von ihrer Aminosäurezusammensetzung und Sequenz bestimmt wird. Der Ordnungszustand der Kette eines gefalteten Proteins kann mit traditionellen Mitteln bestimmt werden. Genauso wichtig ist es aber den Ordnungszustand und die Dynamik der flexiblen Kette quantifizieren zu können – wenn es sich um die Mechanismen der Proteinfaltung handelt, sowie um die Proteinfehlfaltung, die degenerativen Krankheiten wie Alzheimer zugrunde liegt, oder um die Peptide oder Proteine, die flexibel bleiben müssen, um ihre biologische Aktivität auszuüben. Nach Schätzungen ist etwa jedes dritte Protein ein solches IDP („Intrinsically Disordered Protein“). Bevor das Verhalten langer Polypeptidketten verstanden und aus der Sequenz vorhergesagt werden kann, sollte dies zunächst für die kurze Kette gelingen. Zum Studium kurzer Polypeptide wurden zwei Methoden entwickelt die beide Fluoreszenz nutzen und in diesem Projekt erstmals kombiniert wurden. Mit sdFRET („short-distance Förster Resonance Energy Transfer“) wurde auf die Struktur der Kette gezielt und ketteninterne Distanzen im zuvor nicht zugänglichen 10 Å Bereich gemessen. Mit CIFQ („Collision-Induced Fluorescence Quenching“) wurde auf die Flexibilität der Kette gezielt und die Kollisionsfrequenz fluoreszenz-markierter Kettenbereiche, hier der Kettenenden, gemessen. In Theorie und Anwendung von FRET auf die Polypeptidkettenstruktur und –dynamik wurden grundlegende Fortschritte erzielt. Ein Grundlagenproblem in zeitaufgelösten FRET Messungen ist der Beitrag der Kettenbeweglichkeit zum Ausmaß des Energietransfers. Die Haas–Steinberg Gleichung, die dies berücksichtigt, ist eine partielle Differentialgleichung, die nur mit numerischen Methoden gelöst werden kann. Weiterhin lassen sich Ihre Parameter – die Verteilung der beobachteten Distanz, und der Diffusionskoeffizient, der die Kettenbeweglichkeit beschreibt – nur durch die globale Analyse einer Serie von FRET-Messungen gewinnen. Da kommerzielle Software hier überfordert ist und es keine Vorlage gab, wurde eine eigenständige Software in MatLab entwickelt, die Simulationen und globale Analysen ermöglicht. Es wurde nachgewiesen, dass globale Analysen in der Vergangenheit oft nur auf Intuition beruhten und des theoretischen Fundaments entbehrten. Dieses Programm wird bereits jetzt auf Anfrage zur Verfügung gestellt und soll weiterhin mit einem GUI ausgestattet werden. Es gelang Experiment, Simulation und Theorie zu verbinden und zu zuvor unbekannten Abhängigkeiten zu gelangen – so zur symmetrischen Abhängigkeit des diffusionsinduzierten Energietransfers von Diffusionskoeffizient und radiativer Lebensdauer des Donors und zur Abhängigkeit der gemessenen effektiven Distanz von der Quantenausbeute des Donors. Weiterhin konnte Diffusion in die traditionelle FRET-Analyse eingefügt werden, in der die reale Distanzverteilung und die interne Kettendiffusion mit einem einzelnen Parameter beschrieben wird: der effektiven Distanz. Die Methoden sdFRET und CIFQ wurden als Tandem eingesetzt, um die Struktur und Dynamik kurzer IDP Modellpeptide in Abhängigkeit ihres Ladungszustandes zu untersuchen. Die bestehende Vorstellung war, dass interne Coulomb-Abstoßung die Ausdehnung der Kette bestimmt und ihre biologische Aktivität moduliert. Mit CIFQ und sdFRET wurde hingegen gefunden, dass sich die Struktur und Dynamik von kurzen Polypeptiden aus sauren Aminosäuren selbst dann nicht ändert, wenn ihr Ladungszustand von +0 auf bis zu –7 variiert wird. Dies widersprach auch modernen molekulardynamischen Simulationen, die eine Expansion der Ketten voraussagten. Diese trat jedoch nicht ein, wenn fest gebundenes carboxylatfixiertes Wasser als Nebenbedingung verwendet wurde, um spezifische Ioneneffekte zu berücksichtigen. Dieses folgenreiche Ergebnis weist den Weg zu zuverlässigeren Simulationen der Polypeptidkette. Aufgrund seiner einzigartigen Eigenschaften ermöglicht das Fluorophor Diazobicyclo-[2.2.2]-oct-2-en (DBO) sowohl CIFQ als auch sdFRET und wird in vielen anwendungszugeschnittenen Varianten benötigt. Die bestehenden Synthesewege waren in mehreren Punkten limitiert, unwirtschaftlich und aufwendig. Durch die Identifizierung neuer Ausgansprodukte und die Einführung neuer Strategien gelang es, die DBO Chemie weit zu öffnen. Mittlerweile sind ca. 30 neue Zielstrukturen hergestellt worden, mit Syntheseprotokollen, welche auch reaktive DBO-Derivate auf breiter Basis zugänglich machen.
Publications
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