Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von hochmolekularen Multiproteinkomplexen der t(4;11) Translokation
Final Report Abstract
Hochrisiko-Leukämien bei Kleinkindern und Säuglingen sind häufig mit der chromosomalen Translokation t(4;11) assoziiert. Bei dieser reziproken Translokation werden die zwei Gene MLL (11q23) und AF4 (4q21) so miteinander rekombinie-t, dass zwei Fusionsgene an den Chromosomenbruchstellen entstehen. Die dadurch kodierten Fusionsproteine setzen wesentliche Funktionen der beiden Wildtypproteine MLL und AF4 ausser Kraft. Um Verständnis darüber zu generieren, welche Konsequenzen diese Situation für betroffene Leukämiezellen hat, sollte in dem hierdurchgeführten Projekt Ma 1876/7-1 bzw. Ka 783/4-1 die Funktionsweise der beiden t(4;11) Fusionsproteine MLL-AF4 und AF4-MLL durch biochemische Reinigung beider Proteinkomplexe eruiert werden. Dazu wurde das AF4-MLL und MLL-AF4 Protein in menschlichen Zellen überexprimiert und anschtiessend durch affinitätschromatografische Verfahren aus menschlichen Zellen gereinigt. Alle Experimente wurden mit transient transfizierten Zellen durchgeführt. In der Regel wurden 5 x 108 bzw. 1 x 109 Zellen transient transfiziert und nach 2 Tagen geerntet. Transfektionsprotokolle und Zellaufschlussprotokolle wurden dazu optimiert. Als Affinitäts-Tag wurde e;n kommerzieller Strep-Tag verwendet. Eine Reinigung des AF4»MLL Proteinkomplexes konnte erfolgreich durchgeführt werden. Durch massenspektrometrische Analysen, sowie anschliessenden Western-Blot und Co-IP Experimente konnte die Zusammensetzung dieses Multiprotein-Komplexes weitestgehend aufgeklärt werden. Versuche, den MLL-AF4 Komplex zu reinigen und zu charakterisieren, werden durch eine Seneszenz- Induktion verhindert. Allerdings lassen sich auch hier aus den ersten Daten bestimmte Vorhersagen zur Wirkung dieses Komplexes in eukaryonten Zellen vorhersagen. Interessanterweise bildet sich ein t(4;11) Superkomplex, wenn beide Fusionsproteine gleichzeitig exprimiert werden. Dieser t(4;11) Superkomplex hat Eigenschaften des MLL und AF4 Multiproteinkomplexes, allerdings in gemischter Konfiguration, sodass eine fehlerhafte Epigenetik daraus resultiert. MLL-AF4 allein führt zu einer globalen H3K79 Signatur an MLL Zielgenen. AF4-MLL verursacht eine globale H3K4 Signatur an ubiquitären Stellen des Genoms (E2F-, NFkB- und wahrscheinlich AP-Zielgene). Gleichzeitig aktiviert er die RNA Polymerase II durch pTEF-B (Komplex aus CDK9 und CyclinTI) und bringt sie durch CTDPhosphorylierung in die elongative Form. Der t(4;11) Supekomplex beinhaltet beide Eigenschaften und kann so ubiquitär eine epigenetische Neuprogrammierung erzeugen, die dann u.U. auch zu einer Reaktivierung von stumngeschalteten Genen führen sollte. Dadurch könnte dieser Komplex (auch der AF4*MLL Komplex) eine Dedifferenzierung von Zellen einleiten, die eine Tumorbildung begünstigt. Weitere Arbeiten mit diesen Komplexen sollen diese wichtigen Fragestellungen beantworten.
Publications
- Gaussmann A, Wenger T, Eberle l, Bursen A, Bracharz S, Herr l, Dingermann T, Marschalek R. Combined effects of the two reciprocal t(4;11) fusion proteins MLL-AF4 and AF4«MLL confer resistance to apoptosis, cell cycling capacity and growth transformation. Oncogene. 2007 May 17;26{23):3352-63. Epub 2006 Nov 27.
- Kowarz E, Burmeister T, Lo Nigro L, Jansen MW, Delabesse E, Klingebiel T, Dingermann T, Meyer C, Marschalek R. Complex MLL rearrangements in t(4;11) leukemia patients with absent AF4-MLL fusion allele. Leukemia. 2007 Jun;21(6):1232-8. Epub 2007 Apr 5.
