New approaches to reveal quantitative free energy landscapes in molecular interactions by single molecule force spectroscopy
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Im Rahmen dieses Projekts wurde die Kraftspektroskopie zur Quantifizierung von inter- und intramolekularen Wechselwirkungen eingesetzt. Kraftmikroskopie wurde genutzt, um Molekülinteraktionen mit Auflösung im Nanometer-Bereich darzustellen. Dadurch wurden neue Erkenntnisse über molekulare Interaktionen bei diversen biologischen Systemen gewonnen. Gleichzeitig wurde an der Weiterentwicklung der kraftspektroskopischen Methodik gearbeitet. Zur Verbesserung der Algorithmen zur Datenanalyse der Kraftspektroskopie ist es gelungen, eine Formel zu erarbeiten mit der sich aus den gemessenen Kräften unmittelbar zum einen die Form der freien Energielandschaft als auch die freien Aktivierungsenergien und die Exponential-Vorfaktoren der Arrheniusgleichung ableiten lassen. Während bei der üblichen Auswertung der gemessenen Kräfte lediglich die Kräfte im Moment des Abrisses in die Berechnung eingehen, bezieht der neue Algorithmus zusätzlich auch die Messpunkte mit ein, bei denen es noch nicht zu einem Abriss kam, und berechnet daraus die kraftabhängigen Dissoziationsraten, die sonst nur über Force-Clamp Messungen zugänglich waren. Daraus rekonstruiert er dann direkt die Form des Bindungspotentials. Besonders interessant sind multivalente Interaktionen mit einer komplexeren Potentialfläche. NTA-His-Tag ist in der molekularen Biologie eine viel genutzte Interaktion, sowohl zur Aufreinigung von Proteinen als auch zur gezielten Fixierung von Biomolekülen auf Oberflächen. In Kooperation mit Jakob Piehler wurde in diesem Projekt die Wechselwirkung zwischen einem dreifach-NTA-Rest mit verschieden langen Histidin-Tags vermessen. Dabei zeigte sich interessanterweise, dass der untersuchte dreifach-NTA trotz wesentlich erhöhter Avidität im Vergleich zum einfach-NTA keine erhöhte Haltekraft hat. Die Ergebnisse zeigten, dass die spezifische räumlich Anordnung des dreifach-NTA zu einem seriellen Trennen der einzelnen NTA-His2 Interaktionen führte und zu keiner signifikanten Erhöhung der Haltekraft im Gesamtsystem. Hier ist noch viel Spielraum für das Design weiterer Komplexe mit dem Ziel eine Anordnung zu finden, die einzelnen Wechselwirkungen simultan belastet und so eine erhöhte Haltekraft aufweist. Weiterhin wurde der Einfluss verschiedener kompatibler Solute (Ectoin, Betain, Taurin) auf die Stabilität des Membranproteins Bakteriorhodopsin (BR) mittels Einzelmolekül- Kraftspektroskopie vermessen. Unter Solut-Einfluss war die Entfaltung von BR unter Krafteinwirkung erschwert, was sich in erhöhten Entfaltungskräften äußerte. Darüber hinaus sank die Persistenzlänge des entfalteten Aminosäurestranges, was heißt dass die Tendenz des entfalteten Stranges zur Aufknäuelung verstärkt wird und die Rückfaltung des Proteins begünstigt wird. Insgesamt zeigt sich hiermit, dass die Osmolyse die intramolekularen Wechselwirkungen im membranständigen BR verstärken, obwohl sie keine spezifischen Wechselwirkungen mit dem Protein eingehen. In einem weiteren Projektteil haben wir die Interaktionen von einzelnen Transmembranhelices in einer nativen Biomembran untersucht, und zwar der Untereinheiten innerhalb des Lichtsammelkomplexes II (LH2) des Bakteriums R. photometricum. Trotz bekannter Kristallstruktur von LH2, war vor Beginn der Arbeiten wenig über die Kräfte und Bindungsenergien bekannt, die zwischen den 9 Untereinheiten des LH2 Komplexes wirken. Zum Verständnis ist dabei wichtig dass der LH2 Ring nicht aus einem einzelnen Protein besteht, sondern aus mehreren nicht-kovalent verbundenen Polypeptid-Ketten. Die Entfaltung eines solchen Komplexes ergab Kraftkurven mit wiederholte Kraftspitzen in periodischen Abständen, aus denen sich ableiten ließ das die Wechselwirkung zwischen den verschiedenen Untereinheiten schwach ist, jede einzelne Untereinheit in sich selbst aber sehr stabil ist. Die Information trug zum Verständnis der molekularen Wechselwirkungen bei, die dem Protein Assembly im Photosyntheseapparat zugrunde liegen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
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"Forces guiding assembly of light-harvesting complex 2 in native membranes", PNAS (2011) Bd. 108, S. 9455-9459
L.N. Liu, K. Duquesne, F. Oesterhelt, J.N. Sturgis and S. Scheuring
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“Effect of the compatible solute ectoine on the stability of the membrane proteins”, Protein Pept Lett. (2012) Bd. 8, S. 791-794
A. Roychoudhury, D. Haussinger, F. Oesterhelt
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“Double-strand DNA end-binding and sliding of the toroidal CRISPR-associated protein Csn2”, Nucleic Acids Res. (2013) Bd. 41, S. 6347-6359
Z. Arslan, R. Wurm, O. Brener, P. Ellinger, L. Nagel- Steger, F. Oesterhelt, L. Schmitt, D. Willbold, R. Wagner, H. Gohlke, S.H. Smits and Ü. Pul
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“Membrane protein stability depends on the concentration of compatible solutes - a single molecule force spectroscopic study”, Biol Chem. (2013) Bd. 394, S. 1465-1474
A. Roychoudhury, A. Bieker, D. Häussinger, F. Oesterhelt
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“Engineered aggregation inhibitor fusion for production of highly amyloidogenic human islet amyloid polypeptide”, J. Biotechnol. (2014), Bd. 191, S. 221-227
E.A. Mirecka, L. Gremer, S. Schiefer, F. Oesterhelt, M. Stoldt, D. Willbold, W. Hoyer
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“Immobilization of monomeric, oligomeric and fibrillar Aβ species for reliable SPR measurements”, PLoS One (2014) Bd. 9, S. e89490
D. Frenzel, J.M. Glück, O. Brener, F. Oesterhelt, L. Nagel-Steger, D. Willbold
