Gewinnung von pharmakologisch relevanten Triterpenen aus pflanzlichen Zellkulturen am Beispiel von Olenanol- und Ursolsäure
Final Report Abstract
Die beiden Triterpene Oleanol- und Ursolsäure sind auf Grund ihrer Eigenschaften, wie entzündungshemmend, hepatoprotectiv, antimikriobiell oder antitumoral, von pharmakologischem Interesse. Um diese pflanzlichen Inhaltstoffe der pharmazeutischen Industrie zugänglich zu machen, bedarf es hochreiner Ausgangsstoffe bzw. Extrakte von gleichbleibender Qualität und Quantität. Auf Feldern oder in Gewächshäusern angebaute Pflanzen weisen jedoch, abhängig von verschiedenen Umwelteinflüssen, unterschiedliche Produktgehalte auf. Eine Alternative stellen pflanzliche in vitro Kulturen dar, die in geschlossenen Bioreaktorsystemen ganzjährig und unter steuerbaren Bedingungen Wirkstoffe produzieren können. Das Projekt „Gewinnung von pharmakologisch relevanten Triterpenen aus pflanzlichen Zellkulturen am Beispiel von Oleanol- und Ursolsäure“ hatte daher zunächst die Etablierung und Selektion von geeigneten Zellsuspensionskulturen zum Ziel. Die Zielprodukte Oleanol- und Ursolsäure werden von der Pflanzengattung Salbei produziert, weshalb Zellsuspensionskulturen von verschiedenen Salbeiarten erzeugt wurden. Die Gehalte in den Kulturen sind anfangs meist gering und müssen mit Hilfe verschiedener Optimierungsstrategien erhöht werden. Eine Möglichkeit, auf die im Projekt zurückgegriffen wurde, war die genetische Optimierung. Es wurden geeignete DNA-Konstrukte, die Gene für die Saccharosetransporter enthalten, erzeugt und über eine Agrobacterium-Transformation in die Pflanzenzellen übertragen. Dies führte zu einer verstärkten Zuckeraufnahme der Zellen, die eine höhere metabolische Aktivität der Zellen und somit eine erhöhte Produktion der Zielsubstanzen bewirken soll. Weiterhin wurde das Kultivierungsmedium der Zellsuspensionskulturen hinsichtlich der Ionenzusammensetzung optimiert, was zu einer 7-fach höheren Produktausbeute führte. Ein weiterer wichtiger Schritt war die Entwicklung von Prozessabläufen zur Extraktion und Aufreinigung der Triterpene, die intrazellulär vorliegen. Neben dem enzymatischen Zellaufschluss zeigten auch entsprechende mechanische Methoden sehr gute Erfolge. Als besonders geeignet erwies sich der Einsatz einer French-Press, in der die Zellen mit Ethanol als Extraktionsmittel aufgeschlossen wurden. Durch diese Vorgehensweise können einerseits Zellaufschluss und Extraktion in einem Schritt erfolgen und andererseits ist eine kontinuierliche Prozessweise möglich. Der nächste Schritt umfasst die Isolation der Produkte. Hierzu wurden verschiedene Materialien hinsichtlich ihrer Eignung, die Triterpene zu adsorbieren, untersucht, z.B. XAD-16 und Bentonit. Bentonit, ein natürlich vorkommendes Mineral, zeigte vielversprechende Eigenschaften bei der Adsorption und Desorption der Zielsubstanzen, was eine Aufkonzentration von Oleanol- und Ursolsäure im Labormaßstab erlaubte. Neben der Gewinnung der beiden Triterpene, sollten auch Möglichkeiten der Biotransformation zu Derivaten oder ihre Umwandlung ineinander untersucht werden. Dafür gibt es mehrere Gründe. Zum einen unterscheiden sich die beiden Triterpene strukturell kaum und die Umwandlung der einen in die andere Triterpensäure oder die Bildung eines einzigen Derivates, könnte die Ausbeuten erhöhen und die Aufreinigung erleichtern. Weiterhin haben auch Derivate der beiden Säuren pharmakologisch nützliche Eigenschaften. Daher wurde eine Vielzahl von Mikroorganismen auf ihre Tauglichkeit gescreent, wobei das Bakterium Nocardia iowensis eine gute Biotransformationsleistung zeigte. Damit gelang es, die beiden Triterpensäuren in ihre Methylester umzuwandeln. Diese weisen im Vergleich zu den reinen Säuren z.B. eine höhere anti-HIV Wirkung auf. Um den Prozess effizienter zu gestalten, kamen die Nocardiazellen in Alginat immobilisiert zum Einsatz, was eine Wiederverwendung ermöglicht. Außerdem wurde nachgewiesen, dass die Biotransformation auch funktioniert, wenn 50 % des Mediums mit Zelllysat aus dem French-Press-Prozess ersetzt werden. Dies macht eine Isolierung von Oleanol- und Ursolsäure vor der Biotransformation hinfällig und erhöht die Wirtschaftlichkeit des Prozesses. Mittels HPLC-MS/MS und HPLC-NMR konnten die Produkte der Biotransformation von N. iowensis identifiziert und auf dieser Basis neue Transformationsrouten bzw. Stoffwechselwege vorgeschlagen werden. Im Projekt wurden, unter Zusammenarbeit von 3 Arbeitsgruppen der TU Kaiserslautern bzw. der TU Dresden, die einzelnen Prozessschritte erfolgreich etabliert, die eine biotechnologische Gewinnung von Oleanol- und Ursolsäure erlauben. Die im Rahmen dieses Projektes erzielten Forschungsergebnisse bilden somit die Grundlage für die Zusammenführung der einzelnen Teilschritte zu einem wirtschaftlichen Gesamtprozess, in dem das Potenzial weiterer Optimierungen im Folgenden ausgeschöpft werden kann.
Publications
- Gewinnung von Triterpenen aus Pflanzenzellkulturen. 28. DECHEMA- Jahrestagung der Biotechnologen, Aachen 21. – 23. September 2010
M. Scheller, K. Muffler, G. Wünsch, D. Leipold, E. Neuhaus, T. Möhlmann, T. Bley, J. Steingroewer, C. Haas, R. Ulber
- Influence of phytohormones on the ploidy levels of Salvia officinalis callus cultures. 20th Annual Conference of the German Society for Cytometry (DGfZ), Leipzig 13. – 15. Oktober 2010
K. Helbig, Ch. Haas, J. Steingroewer, Th. Bley, J. Weber
- „Biotransformation of triterpenes“ Review Paper, Process Biochemistry (2010), 46 (1), 1-15
K. Muffler, D. Leipold, M.-C. Scheller, C. Haas, J. Steingroewer, T. Bley, E. Neuhaus, M.A. Mirata, J. Schrader, R. Ulber
- Phytochemical study of plants and plant cell cultures of three Salvia species. GA 2011 - 59th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural Product Research, Antalya, Türkei 4.-9. September 2011
S. Schulz, C. Haas, S. Berkov, A.I. Pavlov, R. Ulber, E. Neuhaus, T. Bley, J. Steingroewer
- Production of biologically active triterpenes by biotransformation. 1st European Congress of Applied Biotechnology / 29th DECHEMA's Biotechnology Annual Meeting, Berlin 25. – 29. September 2011
K. Muffler, M.C. Scheller, B. Ludwig, D. Leipold, T. Möhlmann, E. Neuhaus, J. Steingroewer, C. Haas, T. Bley, R. Ulber
- Immobilisierung von Nocardia iowensis zur Biotransformation von bioaktiven Triterpenen. ProcessNet-Jahrestagung und 30. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, Karlsruhe 10. – 13. September 2012
B. Ludwig, K. Muffler, D. Leipold, T. Möhlmann, E. Neuhaus, J. Steingroewer, C. Haas, T. Bley, R. Ulber
- Oleanolic acid and ursolic acid production by in vitro cultures of Salvia species. Dechema Vortrags- und Diskussionstagung: Biopharmazeutische Produktion, Freiburg 14. – 16. Mai 2012
Ch. Haas, S. Schulz, K.-C. Hengelhaupt, T. Möhlmann, B. Ludwig, K. Muffler, E. Neuhaus, R. Ulber, T. Bley, J. Steingroewer
- Biotransformation von Triterpenen mittels Nocardia iowensis. GVC/DECHEMA Vortrags- und Diskussionstagung - Effiziente Verfahren und Anlagen in der Bioverfahrenstechnik und Lebensmittelbiotechnologie, Bad Wildungen 06. – 08. Mai 2013
B. Ludwig, K. Muffler, D. Leipold, T. Möhlmann, E. Neuhaus, J. Steingroewer, C. Haas, T. Bley, R. Ulber
