Einfluss von Position und lokaler Häufung (Clustering) der oxidativen DNA-Basenmodifikation 7,8-Dihydro-8-oxoguanin auf Genexpression und DNA-Reparatur in Säugerzellen

• Antragsteller: Professor Dr. Andriy Khobta
• Fachliche Zuordnung: Toxikologie, Laboratoriumsmedizin ; Public Health, Gesundheitsbezogene Versorgungsforschung, Sozial- und Arbeitsmedizin
• Förderung: Förderung von 2010 bis 2023
• Projektkennung: Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - Projektnummer 157391409

Ziel des Projekts ist, die Auswirkungen der oxidativen DNA-Basenmodifikation 7,8-Dihydro-8-oxoguanin (8-oxoG) auf die Genexpression aufzuklären sowie die Besonderheiten der DNA-Reparatur von 8-oxoG im Kontext verschiedener DNA-Sequenzumgebungen, in Anwesenheit von mehrfachen DNA-Läsionen (lokale Anhäufung der Schäden) und innerhalb von Genelementen mit unterschiedlichen Funktionen zu erforschen. In den vorherigen Projektphasen untersuchten wir den zelluläre Prozessierung einzelner und gehäufter 8-oxoG mit dem Fokus auf transkribierte DNA-Sequenzen. Zu diesem Zweck wurden Reporter-Vektoren erzeugt, die den sequenzspezifischen Einbau von synthetischen DNA-Strängen mit genau positionierten 8-oxoG-Läsionen erlaubten. Mittels quantitativen Expressionsanalysen in humanen und murinen Zellen wurde gezeigt, dass Basenexzisionsreparatur (BER)-Reaktionen die Genexpression beeinträchtigen, während nicht repariertes 8-oxoG gut toleriert wird. Durch chemische und genetische Manipulation der frühen nukleolytischen Schritte der BER konnten wir weiterhin zeigen, dass die BER-Enzyme 8-Oxoguanin-DNA-Glykosyase 1 (OGG1) und apyrimidinische/apurinische Endonuklease (APE1) für die Transkriptionshemmung notwendig sind. Ein wichtiger Befund dabei war, dass die Exzision von 8-oxoG durch humanes OGG1 (der geschwindigkeitslimitierende Schritt der BER-Reaktion) stark von der Anhäufung der Schäden und dem Sequenzkontext abhängt. Hingegen werden die Exzisionsraten durch Positionierung von 8-oxoG in gegensinnigen DNA-Strängen oder dessen Entfernung vom Startpunkt der Transkription kaum beeinflusst. Weitere Ergebnisse lassen vermuten, dass die Intermediate misslungener BER-Reaktionen in einen alternativen Reparaturweg, wie die Nukleodidexzisionsreparatur (NER), übergeleitet werden können. Jetzt planen wir neue Reporter-Konstrukte zu generieren, in denen die 8-oxoG Läsionen in regulatorischen DNA-Elementen positioniert werden können. Das Ziel dabei ist, funktionellen Konsequenzen von 8-oxoG und dessen Reparatur auf Genaktivierung durch diverse Transkriptionsfaktor-Familien (einschließlich CREB, Sp1/Sp2 und Jun) zu erforschen. Zudem soll die mögliche Bedeutung anderer Reparaturwege, insbesondere der zwei Wege der NER, auf die Reparatur der aus 8-oxoG stammenden BER-Intermediate analysiert werden. Die Auswirkungen dieser Intermediate in transkribierter DNA und in den regulatorischen Promotorelementen sind dabei von Interesse. Zu diesem Zweck werden Konstrukte mit BER-resistenten synthetischen 8-oxodG- und AP-Stellen-Analoga (geschützt durch 5'-Phosphorothioat-Bindungen) als BER-Intermediat-Modelle dienen.

• DFG-Verfahren: Sachbeihilfen