Online-Charakterisierung von bioaktiven Substanzen mittels Raman-Spektroskopie zur Prozesssteuerung in Photobioreaktoren
Zusammenfassung der Projektergebnisse
Zur Entwicklung von ökonomischen, kontrollierbaren biotechnologischen Produktionsprozessen ist die Entwicklung von nicht-invasiven, online-Messtechniken im Gegensatz zu offline-Messtechniken aufgrund des Zeitaufwandes, der Komplexität und der damit verbundenen Kontaminationsgefahr anzustreben. In diesem Projekt wurden insbesondere der Einsatz von laserspektroskopischen Messverfahren – der in-situ-Raman-Spektroskopie – zur Entwicklung und Prozesscharakterisierung, zur Prozesskontrolle und Optimierung der Produktbildung der Mikroalge Porphyridium purpureum in Photobioreaktor-Screening-Modulen (PSM) untersucht. Im Fokus hierbei standen vor allem High-Value-Products (im Folgenden als Marker/Zielsubstanz tituliert) wie mehrfach-ungesättigte Fettsäuren, Pigmente und antiviral wirksame, sulfatierte Exopolysaccharide (EPS). Um die prinzipielle Eignung der Raman-Spektroskopie als online-Messmethodik zu untersuchen, musste zuerst das Wachstumsverhalten der Mikroalge P. purpureum (Kultivierungszeit ca. 2 Wochen) charakterisiert werden. Hierzu wurden die vorhandenen PSM mit zusätzlichen Regelungs-/Steuerungseinheiten ausgestattet. Im Anschluss wurden die ausgewählten Marker/Zielsubstanzen von beiden Lehrstühlen zeitgleich untersucht. Dazu war es notwendig, für jede der Marker/Zielsubstanzen entsprechende offline-Down-Stream-Prozesse und definierte Analysemethoden zu entwickeln. um den Ramanspektroskopischen Untersuchungen Referenzproben zukommen lassen zu können. Im Zuge des Projektes stellte sich heraus, dass die Resultate der offline-EPS-Bestimmungsmethoden im Kulturmedium im Verhältnis zu den Ergebnissen aus den spektroskopischen Analysen anderer Zielsubstanzen am aussagekräftigsten waren, um eine Raman-Messtechnik zu entwickeln. Aus diesem Grund konzentrierten sich dann sämtliche Untersuchungen auf die Stoffgruppe der EPS. Zur Optimierung des Gehaltes an EPS bzw. der wirtschaftlich relevanten Größe der Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) wurde ein nicht-linearer statisch-globaler Suchalgorithmus (als Simplex-Algorithmus tituliert) angewendet. Unter Zuhilfenahme des Simplex-Algorithmus konnte eine über 100 %ige Steigerung der RZA erreicht werden, jedoch zeigte sich, dass die biosynthetisierten Proben ein Fluoreszenzsignal emittieren, welches das Raman-Signal überlagert und dessen Auswertung stört. Auf Grundlage dessen wurde ein zweites Raman-Messsystem entwickelt, das als Funktionsprinzip die anregungslinienverschobene Raman-Differenz-Spektroskopie (SERDS: Shifted-Excitation Raman Difference Spectroscopy) hat und auf eine Minimierung des Fluoreszenzhintergrunds abzielte und diese tatsächlich bewirkte. Um eine genügend große Menge an Proben (EPS) zu generieren und zu untersuchen wurde ein Scale-Up im 25 l Airlift-Medusa-Reaktor gefahren. Mittels dieser reaktortechnischen Verfahrensweise konnte eine chemometrische Signalauswertung etabliert werden. Hierbei wurden zunächst die standardmäßig eingesetzte partielle lineare Regression, basierend auf der kleinsten Fehlerquadratmethode (Partial Linear Least Squares Regression, PLSR) untersucht. Aufgrund von Nichtlinearitäten im Datensatz wurde eine nichtlineare Regression mittels Support Vector Machines (SVR) zur Signalauswertung etabliert. Dazu wurden EPS-Proben aus verschiedenen verfahrenstechnischen Kultivierungsführungsweisen (batch-, repeated-batch- und Erhöhung der Photonenflussdichte (PFD)) eingesetzt. Während dieser Untersuchungen konnte eine zusätzliche Steigerung der RZA von bis zu 85 % im Vergleich zu Standardreaktionsbedingungen erreicht werden. Die Güte und Qualität der entwickelten Auswertemethoden für einen Online-Einsatz wurde abschließend untersucht. Dazu wurde zunächst eine PSM-Kultivierung durch eine Schüttelkolbenkultur simuliert und vermessen. Hierbei stellte sich heraus, dass die entwickelte SVR-Methodik um den Faktor 16 genauere Ergebnisse im Vergleich zur PLSR-Methodik liefert. Letztendlich wurde das entwickelte Raman-Messsystem in Kombination mit der nichtlinearen SVR-Signalanaylse anhand einer 14-tägigen Kultivierung validiert. Dabei wurden kontinuierlich im Minutentakt Raman-Messdaten aus dem Reaktorsystem gewonnen. Somit konnte durch die Zusammenarbeit der beiden Lehrstühle zum einen ein grundlegendes nichtinvasives, online Raman-Messsystem zur Prozesscharakterisierung der Kultivierung von Mikroalgen (insbesondere der Mikroalge P. purpureum) entwickelt und zum anderen die Biosynthese der Zielsubstanz EPS bzgl. der RZA über 100 % gesteigert werden. Die Benutzung des Bypass-Systems stellt fortführend die Möglichkeit dar ein Reaktorsystemwechsel so einfach wie möglich zu gestalten. Dies würde wie die im Fortsetzungsantrag angedachte Möglichkeit zur weiteren Untersuchung der Raman-Messtechnik in den für die Bioverfahrenstechnik u.a. industriell wirtschaftlich relevanten Rührkesselreaktoren erlauben und zeitgleich aufgrund des homogenen Strömungsfeldes eine wesentliche Zeit- und Kostenersparnis ermöglichen.
Projektbezogene Publikationen (Auswahl)
- Concentration-dependent hydrogen-bonding effects on the dimethyl sulfoxidevibrational structure in the presence of water, methanol, and ethanol ChemPhysChem, 11, 630-637, 2010
K. Noack, J. Kiefer, A. Leipertz
- Vibrational structure of the polyunsaturated fatty acids eicosapentaenoic acid and arachidonic acid studied by infrared spectroscopy Journal of Molecular Structure, 965, 1-3, 121-124, 2010
J. Kiefer, K. Noack, J. Bartelmess, C. Walther, H. Dörnenburg, A. Leipertz
- Nelder-Mead-Simplex Algorithm – An Optimization Strategy For Increasing The Production Of Exopolysaccharides In Porphyridium Purpureum BIT's 1stAnnual World Congress of Marine Biotechnology; Dalian, China; Mai 2011
M. G. Schirmer, M. Kusche, B. C. Klein; H. Dörnenburg, R. Buchholz
- Optimisation of exopolysaccharide biosynthesis by Porphyridium purpureum 4th Congress of the International Society for Applied Phycology; Halifax, Kanada; Juni 2011
M. Schirmer, B. Klein, M. Kusche, K. Noack, J. Kiefer, A. Leipertz, H. Dörnenburg, R. Buchholz
- Polarized Shifted Excitation Raman Difference Spectroscopy as Monitoring Technique for Biological Fluid Phase Systems Sixth International Conference of Advanced Vibrational Spectroscopy (ICAVS-6), Sonoma County, Kalifornien, USA, Juni 2011
K. Noack, N. Heil, J. Kiefer, A. Leipertz
- Raman spectroscopy for monitoring the cultivation progress of Porphyridium purpureum 1st European Congress of Applied Biotechnology (ECAB), Berlin, Germany, September 2011
K. Noack, S. Hubert, M. Schirmer, M. Kusche, J. Kiefer, R. Buchholz, A. Leipertz
- Aufnahme und Verarbeitung Raman-spektroskopischer Signale zur Überwachung von Algenkultivierungen ProcessNet, Karlsruhe, Deutschland, 2012
K. Noack, C. Dilk, M. Schirmer, R. Buchholz, A. Leipertz
- Evaluation of shifted excitation Raman difference spectra to monitor the algal production of bioactive compounds Gordon Conference on Vibrational Spectroscopy, Biddeford, Maine, USA, 2012
K. Noack, C. Dilk, M. Schirmer, J. Kiefer, R. Buchholz, A. Leipertz
- Molecular interactions and macroscopic effects in binary mixtures of an imidazolium ionic liquid with water, methanol, and ethanol, Journal of Molecular Structure, 1018, 45–53, 2012
K. Noack, A. Leipertz, J. Kiefer
- Raman Difference Spectroscopy Approach for Monitoring of a Bioreactor CLEO, San Jose, California, USA, 2012
K. Noack, C. Dilk, M. Schirmer, B. C. Klein, J. Kiefer, R. Buchholz, A. Leipertz
- Raman Spectroscopy for Monitoring the Production of Pharmaceutically Active Compounds in a Bioreactor SciX – The Great Scientific Exchange, Kansas City, 2012
J. Kiefer, K. Noack, C. Dilk, M. Schirmer, R. Buchholz, A. Leipertz
- Background Suppression for Raman Analysis of Pharmaceutically Active Compounds in Fluorescing Media American Pharmaceutical Review, May/June issue, 32-35, 2013
J. Kiefer, K. Noack, A. Leipertz
- Combined shifted-excitation Raman difference spectroscopy and support vector regression for monitoring the algal production of complex polysaccharides Analyst, 138, 5639-5646, 2013
K. Noack, B. Eskofier, J. Kiefer, C. Dilk, G. Bilow, M. Schirmer, R. Buchholz, A. Leipertz
(Siehe online unter https://doi.org/10.1039/c3an01158e) - Determination of the Raman depolarization ratio in optically active samples Analytical Methods 5, 797-800, 2013
J. Kiefer, M. Kaspereit
(Siehe online unter https://doi.org/10.1039/c2ay25987g)
