Automatisiertes Screening-System
Final Report Abstract
Der Routinebetrieb des automatisierten Screening-Systems wurde nach ausgedehnten Vorarbeiten gegen Ende 2011 aufgenommen. Das Einsatzgebiet des automatisierten Screening-Systems liegt derzeit hauptsächlich im Bereich Protein-Engineering, wobei folgende Anwendungen im Vordergrund stehen: (a) das kombinatorische Engineering von Enzymen mit neuen Substratspezifitäten für die Industrielle Biotechnologie, (b) die Selektion von künstlichen Bindungsproteinen mit therapeutischem Anwendungspotential aus molekularen Zufallsbibliotheken, (c) die molekulare Evolution neuartiger Aminoacyl-tRNA-Transferasen zum Zweck des kotranslationalen Einbaus künstlicher Aminosäuren in rekombinante Proteine ("Erweiterung des Genetischen Codes") sowie (d) die Durchführung von Sandwich-ELISAs zur Quantifizierung von durch PASylierung modifizierten Proteinwirkstoffen mit verlängerter Zirkulationsdauer in Plasmaproben von Versuchstieren. Im Fall des kombinatorischen Enzym-Engineerings ist die Screening-Plattform von besonderem Wert, da hiermit Enzymvarianten, die durch gerichtete Zufallsmutagenese erzeugt wurden, individuell auf katalytische Aktivität für vorgegebene Substrate untersucht werden können. Zu diesem Zweck wurden Protokolle etabliert, die ausgehend von einzelnen Bakterienkolonien sowohl die automatisierte gentechnische Produktion im Mikrotiterplattenmaßstab und Affinitätsisolierung der Enzyme in hoher Reinheit (>95 %) als auch die Durchführung nachfolgender katalytischer Assays (photometrisch oder, nach Produktderivatisierung, durch automatisierte HPLC-Analytik) mit dem Laborroboter im Hochdurchsatz gestatten. Im Fokus der Projekte standen mit Dehydrogenasen und Transaminasen zwei für die industrielle Anwendung hochrelevante Enzymklassen. Durch systematisches Screening von Enzymkandidaten aus unterschiedlichen Organismen sowie nachfolgendes Protein-Engineering gelang es erstmals, eine Enzymkaskade zur biokatalytischen Synthese des zur Herstellung biosynthetischer Polymere relevanten Diamins von Isosorbit zu etablieren. Anticaline sind neuartige kleine und robuste Proteine, die ähnlich den Antikörpern medizinisch relevante Liganden oder Zelloberflächenrezeptoren zu binden vermögen, und die mit den Methoden des kombinatorischen Protein-Designs ausgehend von den im menschlichen Körper natürlich vorkommenden Proteinen der Lipocalin-Familie gewonnen werden. Hierbei werden zunächst Kandidaten mit den gewünschten Target- Spezifitäten aus hochkomplexen synthetischen Genbibliotheken mit dem Phage-Display-Verfahren angereichert, woran sich die funktionelle und proteinbiochemische Charakterisierung vielversprechender Wirkstoffkandidaten sowie ggf. eine individuelle Optimierung durch Protein-Engineering anschließt. In diesem Zusammenhang wurde die Screening-Plattform mehrfach erfolgreich eingesetzt, um im Anschluß an die Phage-Display-Selektion – nach Umklonierung der Genkassetten auf einen Vektor für die lösliche Proteinsekretion in E. coli – Anticalin-Kandidaten im Hinblick auf Antigen-Bindungsaktivität und -spezifität zu testen. Bisher gelang es so, Anticaline mit hochaffininen Bindungseigenschaften für die in der Krebstherapie relevanten Tumormarker VEGF-R3 (Hirntumoren) und PSMA (Prostatakrebs) zu identifizieren. Der ortsgerichtete Einbau künstlicher Aminosäuren mit neuartigen Seitenkettenfunktionalitäten in rekombinante Proteine eröffnet eine neue Ära im Protein-Design. Als eine von wenigen Arbeitsgruppen in Deutschland liefern wir hier wesentliche Beiträge zu dem sich rasch entwickelnden und von angloamerikanischen Labors dominierten Gebiet. Bevor sich solche neuen Seitenketten, wie z.B. die "bio-orthogonale" Keto- Gruppe, in Proteine biosynthetisch einbauen lassen, muß zunächst das Enzym, welches eine SuppressortRNA belädt, für das neue Aminosäure-Substrat maßgeschneidert werden. Für diesen Prozeß, bei dem ein von uns entwickeltes neuartiges Verfahren zur fluoreszenzbasierten bakteriellen Zellsortierung eingesetzt wird, hat sich das automatisierte Screening-System in letzter Zeit als besonders hilfreich erwiesen.
Publications
- Coupled enzymatic alcohol-to-amine conversion of isosorbide using engineered transaminases and dehydrogenases. ChemCatChem 2013, 5:3374-3383
A. Lerchner, S. Achatz, C. Rausch, T. Haas, A. Skerra
- Optimisation of a system for the co-translational incorporation of a keto amino acid and its application to a tumour-specific Anticalin. Protein Engineering, Design and Selection, Volume 28, Issue 12, 1 December 2015, Pages 553–565
A. J. Reichert, G. Poxleitner, M. Dauner, A. Skerra
(See online at https://doi.org/10.1093/protein/gzv048) - Stability engineering of the Geobacillus stearothermophilus alcohol dehydrogenase and application for the synthesis of a biobased polyamide 12 precursor. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015
L. Kirmair, D. L. Seiler, A. Skerra
(See online at https://doi.org/10.1007/s00253-015-6930-5) - Engineering of alanine dehydrogenase from Bacillus subtilis for novel cofactor specificity. Biotechnol. Appl. Biochem. Vol 63 Issue 5, September/October 2016, Pages 616-624
A. Lerchner, A. Jarasch, A. Skerra
(See online at https://doi.org/10.1002/bab.1414)
