Multiphotonen-Ausrüstung für ein Konfokales Laserscanning-Mikroskop
Final Report Abstract
Das Institut für Medizinische Strahlenbiologie bearbeitet Fragestellungen auf dem Gebiet der Mechanismen der DNA-Doppelstrangbrüche (DSB)-Reparatur und deren Regulation. Mit der Bewilligung der Anschaffung eines Konfokalmikroskopiersystems im Jahre 2006 konnten wir Experimente mit fixierten Zellen aufnehmen. Die Zusatzbeschaffung ermöglichte uns „Real-Time“ Studien durchzuführen. Folgende Aspekte wurden untersucht: 1. Automatische Quantifizierung von gH2AX Foci als Tool zur Bestimmung von Reparaturkinetiken nach niedrigen Strahlendosen: Mit den entwickelten Analyseverfahren steht uns ein System zur Verfügung, mit dessen Hilfe DSB nach Bestrahlung mit physiologischen Dosen untersucht werden. 2. Mögliche Sättigung der HDR bei hohen Strahlendosen. Wir konnten dokumentieren, dass eine Sättigung von HDR bei höheren Dosen eintritt und untersuchen nun die zu Grunde liegenden Mechanismen. Cyclin B, oder zellzyklusspezifische Proteine (Cdt1 (grün) und Geminin (rot)) werden eingesetzt, um die Zellzyklusphase zu dokumentieren. Dafür wurden Foci-Kinetiken von verschiedenen Zelllinien mittels indirekter Immunofluoreszenz mit Antikörpern gegen Rad51 und Cyclin B1 analysiert. Die Kolokalisation von Rad51 und KAP1 wurde in MEF Zellen untersucht, um Aufschluss über die Lokalisation von Rad51 im Heterochromatin zu erlangen. Live-Cell-Imaging Experimente wurden mit Rad51-GFP transfizierten Zellen durchgeführt, um die Lokalisation von Rad51 in IRIF in Echtzeit zu untersuchen. 3. ATM Aktivierung durch DSB wurde quantifiziert und für unsere Analysen eingesetzt. 4. Live Cell Imaging von Reparaturproteinfoci: Diese Reihe von Experimenten war zentral in der Begründung des Antrages zur Ergänzungsbeschaffung. Wir haben dafür GFP markiertes 53BP1, wie auch eine ganze Reihe weiterer Reparatur- und Signaltransduktionsproteine, eingesetzt. 5. Wir konnten mit Hilfe des Multi-Photonen Lasers DSB (zusammen mit anderen Läsionen) in lebenden Zellen direkt unter dem Mikroskop induzieren, um die zeitliche Abfolge der Reparatur- und Checkpoint-Prozesse zu untersuchen. 6. In unserer Arbeitsgruppe ist ein Modell-System eingeführt worden, dass uns erlaubt, eine definierte Anzahl an DSB enzymatisch (über I-SceI) zu induzieren und dadurch den Einfluss von DSB-Komplexität auf die Reparatur zu untersuchen. Mithilfe von Live-Cell-Imaging Experimenten wurden Unterschiede im DNA-Damage-Response-Signaling zwischen simplen und geclusterten Doppelstrangbrüchen (DSBs) untersucht. Dafür wurden genetisch veränderte wt und DSB-Reparatur Defizienten CHO-Zelllinien eingesetzt, die eine vorher bestimmte Anzahl an Konstrukten mit I-SceI-Erkennungssequenz-Integrationsstellen beherbergen, welche simple, beziehungsweise geclusterte Brüche nach der DSB Induktion durch die Expression von I-SceI modellieren: CHO-1xISceI-D7.C2, CHO-2xISceI-R11.C13, CHO-4xISceI-R11.C3, XRC13-2xISceI-R11.C5, XRS6-2xISceI.R11.C4 und entsprechende Kontrollen. Die Expression und nukleare Lokalisation von I-SceI wurde mittels eines I-SceI-RFP Fusion-Proteins ermittelt. Nach der Kotransfektion von einem I-SceI- und MDC1-GFP- oder 53BP1-GFP-exprimierenden Plasmid wurden die Foci-Kinetiken der Signalproteine für einen Zeitraum von 24 h, 6 h nach der Transfektion, untersucht. Weiterhin wurden 53BP1 Kinetiken sowohl nach der Zugabe der Inhibitoren von Reparaturproteinen unterschiedlicher Reparaturwege (DNA-PKcs, PARP und ATM), als auch nach der Erhöhung der Komplexität der DNA-Schäden zusätzlich zu I-SceI induzierten Brüchen durch die Zugabe von H2O2 untersucht. Um die mittels der Live-Cell-Imaging erhaltenen Ergebnisse zu validieren, wurde auch Immunofluoreszenz mit den oben genannten CHO-Ziellinien mit Antikörpern gegen γ-H2AX, MDC1 und 53BP1 durchgeführt. Weiterhin wurde die Zellzyklusverteilung I-SceI transfizierten Zellen anhand von Live-Cell-Imaging-Experimente mit dem FUCCI-System analysiert. 7. Für ein weiteres Forschungsprojekt wurden diverse Zelllinien mit Plasmiden transfiziert, welche entweder PCNA-BFP, XRCC1-GFP oder Ligase1-dsRed exprimieren. Die Lokalisation dieser Proteine wurde auf den verschiedenen genetischen Hintergründen untersucht. Diese Untersuchungen wurden sowohl mit Live-Cell-Imaging, als auch mit konventioneller Immunfluoreszenz durchgeführt und einer Vergleichsanalyse unterzogen.
Publications
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