Effekt der exzitatorischen synaptischen Aktivität auf die Prozessierung des Amyloidvorläuferproteins APP
Final Report Abstract
Der Bildung von Abeta-Peptiden durch die proteolytische Spaltung des Amyloidvorläuferproteins (APP) wird eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Alzheimerschen Erkrankung zugesprochen. Der nichtpathologische, sekretorische Weg der APP-Prozessierung wird zum Teil durch Diacylglycerol (DAG)-vermittelte Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) reguliert. Allerdings ist die PKC nicht das einzige DAG-sensitive Molekül in dieser Signalkaskade. Wir konnten nachweisen, dass eine Aktivierung des präsynaptischen DAG-Rezeptors Munc13-1 eine Erhöhung der sekretorischen APP-Prozessierung bewirkt, die parallel zu und unabhängig von der PKC-Aktivierung verläuft. Die Degeneration präsynaptischer Neuronenendigungen ist ein Charaktersitikum der Alzheimerschen Erkrankung, das mit dem Ausmaß der Abeta-Pathologie in verschiedenen Hirnregionen korreliert. Dies und die Einbindung von Munc13-1 in die DAG-vermittelte Signalkaskade legen nahe, dass die synaptische Aktivität zur Regulation der APP-Prozessierung beiträgt. Ziel des Projekts war es, zu untersuchen wie hoch der Beitrag der exzitatorischen präsynaptischen Aktivität an der APP-Prozessierung ist und ob auch postsynaptische Mechanismen beteiligt sind. Diesen Fragen sollte in pharmakologischen Stimulationsexperimenten unter Verwendung von organotypischen Hirnschnittkulturen von Munc13-1/2 Doppel knock-out (DKO) Mäusen nachgegangen werden, in denen die Glutamat-Freisetzung vollständig blockiert ist. Die von uns etablierten Hirnschnittkulturen von Munc13-KO Mäusen entwickelten sich wie Wildtyp-Kulturen: alle neuronalen Marker wurden zum gleichen Zeitpunkt und im gleichen Ausmaß exprimiert, es gab keine Genotyp-abhängige Toxizität und Glutamat-Rezeptoren wurden in allen Genotypen gleichermaßen nachgewiesen. Insgesamt hat die „normale“ Entwicklung der Munc13-1/2 DKO- Kulturen sehr überrascht, da dies eigentlich bedeutet, dass glutamaterge Transmission entbehrlich für die postnatale Entwicklung der untersuchten Marker ist. Insbesondere für die Ausbildung perineuronaler Netze wird in der Literatur die Wichtigkeit der Stimulation postsynaptischer Glutamatrezeptoren hervorgehoben, in den DKO-Kulturen wurden sie aber unverändert ausgebildet. In Stimulationsexperimenten wurde der Zusammenhang zwischen neuronaler Aktivität und APP-Sekretion in Hirnschnittkulturen untersucht. Dabei wurde bei gesteigerter neuronaler Aktivität durch Depolarisation erhöhte APP-Sekretion beobachtet, während Blockade neuronaler Aktivität zu verminderter APP-Sekretion führte. Das Fehlen von Munc13-1 bzw. Munc13-1/2 führte zum Verlust der PMA- Stimulierbarkeit der APP-Freisetzung aus Hirngewebe. Die Abwesenheit von Munc13- 2 allein zeigte diesen Effekt nicht. Nach Blockade präsynaptischer Ca2+ -Kanäle bzw. postsynaptischer Glutamatrezeptoren wurde keine signifikante Änderung der PMA- stimulierten APP-Sekretion beobachtet. Da postsynaptische Glutamatrezeptor-Blocker in unseren Versuchen keinen Einfluss auf die PMA-stimulierte APP-Freisetzung hatten, wurden andere u.U. beeinträchtigte Transmitter-Systeme untersucht und die Expression von Munc13-Isoformen in cholinergen und GABAergen Neuronen des basalen Vorderhirns der Maus mit single cell PCR bestimmt. In beiden Neuronentypen exprimieren ca. 50% der Neuronen nur Munc13-1, ca. 25% lediglich Munc13-2 und weitere 25% beide Munc13-Isoformen. Ein seit geraumer Zeit bestehendes Problem bei der Analytik sekretorischer APP-Fragmente ist das Fehlen geeigneter, spezifischer Antikörper. Derartige Antikörper wurden den von der AG S. Lichtenthaler, LMU München, entwickelt und im Rahmen dieser Studie in Stimulationsexperimenten charakterisiert.
Publications
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Formation of perineuronal nets in organotypic mouse brain slice cultures is independent of neuronal glutamatergic activity. Eur. J. Neurosci. 25, 2640-2648 (2007)
S. Reimers, M. Hartlage-Rübsamen, G. Brückner, S. Roßner
