Genetic engineering of anaerobic O-demethylases
Final Report Abstract
Im Mittelpunkt des Projektes standen die Methyltransferasen I der Vanillat- und Veratrol-O-Demethylase aus Acetobacterium dehalogenans. O-Demethylasen sind Enzymkomplexe, die aus jeweils vier verschiedenen Proteinen bestehen: zwei Methyltransferasen (MT I und MT II), einem Corrinoidprotein (CP) und dem Aktivierenden Enyzm (AE). Die zinkhaltige MT I katalysiert die Spaltung der Substrat-Etherbindung sowie die Übertragung der Methylgruppe vom Substrat auf CP. MT II katalysiert nachfolgend die Übertragung der Methylgruppe von CP auf Tetrahydrofolat. Für die Übertragung der Methylgruppe vom Substrat auf CP muss das Cobalt im gebundenen Cobalamin in der super-reduzierten Oxidationsstufe I vorliegen. Infolge von Autoxidation kann der Cofakor ein Elektron verlieren und in die inaktive Oxidationsstufe II übergehen. AE katalysiert die Reaktivierung (Reduktion) des Corrinoidcofaktors unter Verbrauch von ATP. Durch die gezielte Mutagenese möglicher Zink-bindender Aminosäuren wurde für beide MT I das Zinkbindemotiv identifiziert (MT Ivan: E-X14-E-X20-H; MT Iver: D-X27-C-X39-C). Überraschenderweise ist Cystein bei MT Ivan nicht an der Zinkbindung beteiligt – anders als bei allen anderen bekannten Corrinoid-abhängigen Methyltransferasen. Strukturvorhersagen postulierten für beide MT I eine TIM Barrel-Konfiguration. Durch das Entfernen der ersten 2-3 mutmaßlichen α-Helices des N-Terminus beider MT I wurden Enzyme generiert, die ein erweitertes Substratspektrum zeigten sowie eine gesteigerte Enzymaktivität aufwiesen. Enzymchimären beider Methyltransferasen mit vertauschten N-Termini wiesen eine entsprechend angepasste Substratspezifität auf. Aus diesen Experimenten wurde geschlossen, dass der N- Terminus die für das Substratspektrum bestimmende Domäne darstellt, während der C-Terminus mit den Zink-bindenden Aminosäuren für die Katalyse verantwortlich ist. Während die Nutzung von Phenylmethylethern als Energiesubstrate für Acetogene schon lange Zeit bekannt ist, wurde erst vor wenigen Jahren von unserer Arbeitsgruppe entdeckt, dass diese Substrate auch von Desulfitobacterium spp. demethyliert und als Elektronendonor im Energiestoffwechsel genutzt werden können. Im Rahmen dieses Projektes wurde erstmals eine aktive O-Demethylase von Desulfitobacterium hafniense DCB-2 heterolog exprimiert und charakterisiert. Der Aufbau und die Funktionsweise entspricht dem der entsprechenden acetogenen Enzymsysteme.
Publications
- (2008). Anaerobe O-Demethylierung in Acetobacterium dehalogenans: Untersuchungen zum ATP-abhängigen Aktivierungsmechanismus B12-abhängiger Methyltransferasen
Studenik, S.
- (2008). Enzymes involved in the anoxic utilization of phenyl methyl ethers by Desulfitobacterium hafniense DCB-2 and Desulfitobacterium hafniense PCE-S. Archives of Microbiology 190, 489-495
Kreher S., Schilhabel A., Diekert G.
- (2009). Anaerobe O-Demethylierung in Acetobacterium dehalogenans: Untersuchungen zu den Ether-spaltenden Methyltransferasen I – Zinkbindung und Substratspezifität
Kreher, S.
- (2009). The ethercleaving methyltransferase system of the strict anaerobe Acetobacterium dehalogenans: Analysis and expression of the encoding genes. Journal of Bacteriology 191, 588-599
Schilhabel A., Studenik S., Vödisch M., Schlott B., Pierik A. J., Diekert G.
- (2010). Ether cleaving methyltransferases of the strict anaerobe Acetobacterium dehalogenans: Controlling the substrate spectrum by genetic engineering of the N-terminus. Molecular Microbiology 78, 230-237
Kreher S., Studenik S., Diekert G.
- (2011). The ether-cleaving methyltransferase of the strict anaerobe Acetobacterium dehalogenans: analysis of the zinc-binding site. FEMS Microbiology Letters 318, 131-136
Studenik S., Kreher S., Diekert G.
- (2012). Characterization of an O-Demethylase of Desulfitobacterium hafniense DCB-2. Journal of Bacteriology 194, 3317-3326
Studenik S., Vogel M., Diekert G.
(See online at https://doi.org/10.1128/JB.00146-12)
