Kdp-dependent potassium homeostasis, desiccation tolerance and gene regulation in Halobacterium salinarum as well as functional dynamics of the KdpFABC complex from Escherichia coli
Final Report Abstract
Einzelmolekül-Dynamik und Analyse des Reaktionszyklus der KdpFABC P-Typ ATPase von E. coli: Der KdpFABC Komplex von Escherichia coli ist eine einzigartige P-Typ ATPase, folgt als solche in der Katalyse aber dem für P-Typ ATPasen typischen Post-Albers Reaktionszyklus. Strukturell zeichnet sich dieser Zyklus durch das dynamische Verkippen großer Proteindomänen aus. Um die prognostizierten Konformationsänderungen im katalytisch aktiven Enzym nachzuweisen, wurde der KdpFABC Komplex mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen (Alexa488 und ATTO665) an exponierten Cysteinen in der N- und A-Domäne von KdpB markiert. In Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Michael Börsch (Universität Jena) konnten mittels einer konfokalen Einzelmolekül-FRET Technik erstmals die Konformationsänderungen einer P-Typ-ATPase am arbeitenden Enzym mit hoher Zeitauflösung (d.h. unter 1 ms) beobachtet werden. Weiterhin hat sich gezeigt, dass die Inhibitoren ortho-Vanadat bzw. OCS (oligocyclic suboxide) den KdpFABC Komplex nicht -wie ursprünglich vermutet- in einer bestimmten Konformation blockieren, sondern eher biochemisch inhibieren. Eine weitergehende Charakterisierung der Inhibitoren mittels eines konfokalen ABEL-trap-Mikroskopaufbaus („anti Brownian electrokinetic trap“) war leider nicht möglich, da die vollständige und reproduzierbare Integration des ALEX-FRET Aufbaus mit Ende der Förderperiode aufgrund von technischen Problemen noch nicht abgeschlossen war. - In Zusammenarbeit mit dem Labor von Prof. Dr. Hans-Jürgen Apell (Universität Konstanz) wurde der Versuch unternommen, den Reaktionszyklus der KdpFABC P-Typ ATPase zu analysieren. Es ist gelungen, am rekonstituierten KdpFABC Komplex die elektrogene Pumpaktivität mit Hilfe des Spannungs-abhängigen Fluoreszenzindikators DiSC3(5) zu bestimmen. Als wichtigstes Ergebnis kann man festhalten, dass basierend auf der Energie der ATP Hydrolyse bis zu 3 K+ Ionen über die Membran transportiert werden. H+ Ionen können außer Betracht bleiben, da sie wahrscheinlich „occluded“ sind und nicht transportiert werden. Physiologie und Rolle des Kdp Systems in Halobakterium: Die kontrollierte Expression von Zielgenen ist eine essentielle Methode, um z.B. die Überexpression von Proteinen zu verfolgen. Auf der Basis früherer Untersuchungen, dass die Expression des kdpFABCQ Operons von H. salinarum abhängig von der K+ Konzentration im Medium ist, haben wir mit Hilfe eines E. coli – H. salinarum „shuttle“ Vektors einen Expressionsvektor (pKIX) erzeugt, bei dem das Gen bgaH (kodiert für β-Galaktosidase) unter der Kontrolle des kdp Promotors (Pkdp) steht. Die Ergebnisse zeigen, dass das Expressionsniveau von bgaH eindeutig von der K+ Konzentration im Medium abhängt. Der Einbau von kdpQ als Transkriptionsaktivator und die Einführung von spezifischen Mutationen im Promotorbereich von Pkdp führten zur weiteren Erhöhung der Expressionsrate von bgaH. - Halobacteriales sind dafür bekannt, dass sie Millionen von Jahren in wässrigen Einschlüssen von Salzkristallen überleben können. Um zu zeigen, dass das Kdp System tatsächlich zur Überlebensstrategie von H. salinarum in Salzkristallen beiträgt, wurde der Wildtyp von H. salinarum mit einer entsprechenden kdpFABCQ Deletionsmutante verglichen. Hierbei zeigte sich nicht nur der positive Effekt des Kdp Systems, sondern es wurde auch deutlich, dass der Aufenthalt der Bakterien in den wässrigen Einschlüssen essentiell für das Überleben unter extremer Austrocknung ist. Weitergehende Experimente zur Physiologie, Regulation des kdp Operons und Integration des Kdp Systems in die allgemeine Stressantwort (K+ Limitierung/Wassermangel) sind leider gescheitert, da es nicht gelungen ist, ein in H. salinarum Zellen funktionelles photoaktivierbares GFP zu konstruieren bzw. eine trkH Deletionsmutante zu erzeugen.
Publications
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