Entwicklung Aptamer-basierter Methoden zur Detektion und Aufreinigung rekombinanter Proteine in der Biotechnologie
Final Report Abstract
Das Ziel des Projektes war es, Aptamer-basierte Verfahren zur Detektion und Aufreinigung verschiedener biotechnologisch relevanter Proteine bereitzustellen. Innerhalb des ersten Förderzeitraums konnte gezeigt werden, dass sich Aptamere für die Detektion von Proteinen mittels Microarrays eignen. Dabei konnten Aptamere gegen den His-Tag sowie innerhalb des Projektes selektierte Aptamere gegen das FC-Fragment humaner Antikörper erfolgreich als Detektionsmolekül in den drei verschiedenen Microarray Formaten (Forward Phase, Reverse Phase und Sandwich Assay) eingesetzt werden. Die Aptamere konnten darüber hinaus für die Aufreinigung von rekombinanten Proteinen verwendet werden. Dabei wurden zunächst Gruppenspezifische Aufreinigungsverfahren für His-getaggte Proteinen sowie Antikörper entwickelt. Diese ermöglichen die Proteinaufreiniung mit vergleichbarer Aufreinigungseffizienz wie die herkömmlicherweise verwendeten Methoden IMAC oder Protein A Affinitätschromatographie. Darüber hinaus weisen Aptamere als Affinitätsliganden weitere Vorteile auf, wie beispielsweise in der Target-Elution. So konnten Aptamere gegen das FC-Fragment humaner Antikörper entwickelt werden, die die Antikörperaufreinigung unter milderen Bedingungen erlauben als die typischerweise verwendete Protein A Affinitätschromatographie. Die Methode konnte erfolgreich auch auf weitere Aptamere, die gegen kleine Moleküle (Theophyllin, Ochratoxin A) gerichtet sind, übertragen werden. Innerhalb des Folgeprojektes wurden die Methoden zur Aptamer-basierten Detektion und Aufreinigung auf den humanen Wachstumsfaktor VEGF165 übertragen. Auch für dieses Protein gelang die Aufreinigung unter Verwendung milder Elutionsbedingungen auch aus komplexen Proben. Hinsichtlich der Detektion von VEGF wurden Aptamer-Microarrays entwickelt. Dabei zeigten sich insbesondere Reverse Phase Microarrays geeignet, um VEGF auch in komplexen Proben nachweisen zu können. Darüber hinaus wurde unter Verwendung von porösem Silizium als Transducer ein optischer Sensor zur markierungsfreien Detektion von VEGF getestet. Bei Detektion von VEGF wurde zudem die Hypothese untersucht, ob sich mit Hilfe von Aptameren auch Aussagen über die Konformation von VEGF treffen lassen. Hier konnte ein Aptamer identifiziert werden, dessen Bindung an VEGF über ein konformatives Epitop erfolgt und somit Rückschlüsse auf die Faltung des Proteins zulässt.
Publications
- Aptamere - Die Chemische Alternative zu Antikörpern; 28. Jahrestagung der Biotechnologen, 2010, Aachen
Johanna-Gabriela Walter, Andreas Kage
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Öznur Kökpinar, Johanna-Gabriela Walter, Yuval Shoham, Frank Stahl, Thomas Scheper
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Guohong Zhu, Miriam Lübbecke, Johanna-Gabriela Walter, Frank Stahl, Thomas Scheper
- Aptamers as affinity ligands for downstream processing; Engineering in Life Sciences, 2012, Volume 12, No. 5, 1-11
Johanna-Gabriela Walter, Frank Stahl, Thomas Scheper
- Aptamers as detection molecules on reverse phase protein microarrays for the analysis of cell lysates; Engineering in Life Sciences, 2012, Volume 12, Issue 2, 2012, 144-151
Miriam Lübbecke, Johanna-Gabriela Walter, Frank Stahl, Thomas Scheper
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Michael Meyer, Maren Lönne, Johanna-Gabriela Walter, Thomas Scheper
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Maren Lönne, Johanna-Gabriela Walter, Frank Stahl, Thomas Scheper
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Johanna-Gabriela Walter, Guohong Zhu, Frank Stahl, Thomas Scheper
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Katharina Urmann, Johanna-Gabriela Walter, Esther Segal, Thomas Scheper
(See online at https://dx.doi.org/10.1021/ac504487g) - Aptamer-Modified Magnetic Beads in Affinity Separation of Proteins; Methods in Molecular Biology. In: Reichelt S. (eds) Affinity Chromatography. Methods in Molecular Biology, vol 1286. Humana Press, New York, NY, 2015, pp 67-82. 978-1-4939-2446-2
Guohong Zhu, Johanna-Gabriela Walter
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Maren Lönne, Svenja Bolten, AntoninaLavrentieva, Frank Stahl, Thomas Scheper, Johanna-Gabriela Walter
(See online at https://doi.org/10.1016/j.btre.2015.08.006)
