Role of peptidyl-prolyl cis/trans-isomerases (PPlases) during uptake of binary bacterial toxins into the cytosol of mammalian cells
Final Report Abstract
Bakterielle Proteintoxine wie Diphtherietoxin (DT) oder clostridiale Enterotoxine, die ihre enzymatisch aktive Untereinheit in das Zytosol von Säugetierzellen liefern und dort kovalent ADP-Ribose auf bestimmte Substratproteine übertragen und dadurch Zellen schädigen, gehören zu den potentesten Virulenzfaktoren und lösen eine Vielzahl schwerer Krankheiten bei Mensch und Nutztieren aus. Wird die Aufnahme der ADP-ribosylierenden Untereinheit in das Zytosol verhindert, bleiben Zellschädigung und Krankheit aus. Daher ist die eingehende Charakterisierung der molekularen Mechanismen, die der Aufnahme solcher Bakterientoxine in Zellen zugrunde liegen und noch weitgehend unverstanden sind, von grundlegendem wissenschaftlichem, aber auch medizinischem Interesse. Auf der Grundlage eigener Vorarbeiten zur zellulären Aufnahme der binären Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine Clostridium (C.) botulinum C2-Toxin, C. perfringens Iota-Toxin und C. difficile CDT, bei denen nach Rezeptor-vermittelter Endozytose das Wirstzellchaperon Hsp90 den Transport der jeweiligen Enzymuntereinheit aus sauren Endosomen in das Zytosol vermittelt, wurde im Projekt erstmals nachgewiesen, dass auch Peptidyl-prolyl cis/trans Isomerasen (PPIasen) aus den Familien der Cylophiline (Cyps) und FK506 Bindeproteine (FKBPs), sowie Hsp70 an der Aufnahme verschiedener ADP-ribosylierender Bakterientoxine in das Zytosol menschlicher und tierischer Zielzellen beteiligt sind. Die Ergebnisse sind unseres Wissens die erste Beschreibung überhaupt, dass PPIasen und Hsp70 an der Aufnahme eines Bakterientoxins in Zellen beteiligt sind. In Zellen führte die gezielte pharmakologische Hemmung von Cyps durch CsA und von FKBPs durch FK506 zu einer signifikanten Verzögerung der Vergiftung durch die binären clostridialen Toxine und durch DT, wobei weniger der jeweiligen Enzymuntereinheit der Toxine im Zytosol nachweisbar war. Die PPIase-Inhibitoren verhinderten bei allen Toxinen den Transport der Enzymuntereinheit in das Zytosol, indem sie deren pH-abhängigen Transport über zelluläre Membranen hemmen. Alle erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Transport der Enzymuntereinheiten aus sauren Endosomen in das Zytosol von Cyps, FKBPs, Hsp90 und Hsp70 vermittelt wird, so dass nach deren pharmakologischer Hemmung die Toxine nach ihrer Internalisierung in Zellen ihre Enzymuntereinheit nicht mehr effektiv in das Zytosol liefern können. Interessanterweise benötigen Bakterientoxine, die keine ADP-RT sind, die o.g. Faktoren nicht, um ihre Enzymuntereinheiten in das Zytosol zu transportieren. Die Ergebnisse legen einen neuartigen intrazellulären Transportmechanismus nahe, der spezifisch und selektiv für ADP-ribosylierende Toxine ist, was durch Einsatz einer isolierten ADP- RT-Domäne unterstützt wurde. Wie alle Enzymuntereinheiten der untersuchten ADP-ribosylierenden Toxine, zeigte auch die isolierte ADP-RT-Domäne in biochemischen Analysen eine spezifische Bindung an Hsp90, Cyp40 und FKBP51. Allerdings konnte bisher kein Beweis erbracht werden, dass in Zellen die ADP-RT-Domänen der Toxine mit den Wirtszellfaktoren als Hsp90-Proteinkomplexes interagieren. Schließlich wurde in dem Projekt erstmals gezeigt, dass die gezielte pharmakologische Hemmung der hier identifizierten Wirtszell-Chaperone und -PPIasen menschliche Zellen vor Vergiftung durch die ADP-ribosylierenden Bakterientoxine schützt. Ein nicht-immunsuppressiver Cyp-Inhibitor wurde als wirksamer und nicht-toxischer Inhibitor der binären Toxine und DT in Zellmodellen identifiziert, was zur Entwicklung neuartiger Therapie- und Prophylaxe-Strategien im Rahmen Toxin-assoziierter Lebensmittelvergiftungen und Infektionskrankheiten führen könnte.
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