Structure and formation of PHB granule in bacteria
Final Report Abstract
Im folgenden sind die wichtigsten Ergebnisse aufgeführt: 1. Identifizierung neuer PHB Granula-assozierte Proteine in Ralstonia eutropha H16: Durch die Kombination eines bioinformatischen und Proteom-biochemischen Ansatz wurden zusätzlich zu den neun bisher bereits bekannten PHB Granula-assoziierten Protein (PHB Synthase PhaCl, PHB Depolymerase PhaZal, Phasine PhaPl - PhaP5, PhaR und PhaM) sieben weitere, neue PHB-Granula-assoziierte Protein identifiziert: - PhaC2 (alternative PHB Synthase) - Zwei neue Phasine (PhaP6 und PhaP7) - Zwei neue Subtypen von intrazellulären PHB Depolymerasen (PhaZel und PhaZe2) - Ein Protein mit unbekannter Funktion und entfernter Ähnlichkeit zu Phasin-Proteinen (PhaP8) -Ein Protein mit Ähnlichkeit zu Phospholipasen (bislang konnte nur eine unspezifische Esterase-Aktivität nachgewiesen werden) (PhaL) Für alle neu identifizierten Proteine wurde die in vivo Co-Lokalisation mit PHB Granula durch Konstruktion von N- und C-terminalen Fusionen mit Varianten des green fluorescent protein (GFP) verifiziert. 2. Interaktion von PhaM mit der PHB Synthase PhaC1 und dem Nukleoid: Die von der Zelle gezielte Verankerung von PHB Granula mit der DNA durch Verknüpfung von PhaCl über PhaM mit der DNA wurde durch bimolekulare Fluoreszenzkomplementierung und durch transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen nachgewiesen. 3. PhaM ist der physiologische Aktivator der PHB Synthase: Neben der Funktion einen physikalischen Kontakt zwischen PHB und DNA herzustellen (5) konnte für PhaM auch eine PHB-Synthase-aktivierende Funktion nachgewiesen werden. 4. Interaktion von PHB Granula-assoziierten Proteinen durch Two Hybrid Analyse: Durch Verwendung des Adenylat-Zyklase basierten bakteriellen two-hybrid Systems ("Karimova-Methode") wurden neben der Identifizierung von PhaM als Interaktionspartner der PHB Synthase (im Vorgängerprojekt nachgewiesenen (5)) diverse in vivo Interaktionen zwischen PHB Granula-assoziierten Proteinen identifiziert (insbesondere zwischen Phasinen untereinander). Durch two-hybrid screening wurde ein als PhaX bezeichnetes Protein identifiziert, welches mit der PHB Depolymerase PhaZal und zwei Phasin-Proteinen (PhaP2 und PhaP3) interagiert. Deletionsmutanten (AphaX) sind im PHB Abbau in der stationären Wachstumsphase reduziert und weisen interessanterweise einen stark erhöhten Anteil an Polyphosphat-Granula auf (PhaX ist als hyp. Phosphattransportregulator annotiert). Der physiologischen Funktion von PhaX im PHB und Polyphosphat-Stoffwechsel wird in einem separaten Projekt nachgegangen.
Publications
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2011. Identification of a multifunctional protein, PhaM, that determines number, surface to volume ratio, subcellular localization and distribution to daughter cells of poly(3-hydroxybutyrate), PHB, granules in Ralstonia eutropha H16. Mol Microbiol 82:936-951
Pfeiffer D, Wahl A, Jendrossek D
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2012. Localization of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) granule-associated proteins during PHB granule formation and identification of two new phasins, PhaP6 and PhaP7, in Ralstonia eutropha H16. J Bacteriol 194:5909-5921
Pfeiffer D, Jendrossek D
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2012. PHB granules are attached to the nucleoid via PhaM in Ralstonia eutropha. BMC Microbiol 12:262-273
Wahl A, Schuth N, Pfeiffer D, Nussberger S, Jendrossek D
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2013. Development of a transferable bimolecular fluorescence complementation system for the investigation of interactions between poly(3-hydroxybutyrate) granule-associated proteins in Gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol 79:2989-2999
Pfeiffer D, Jendrossek D
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2014. New insights in the formation of polyhydroxyalkanoate granules (carbonosomes) and novel functions of poly(3-hydroxybutyrate). Environ Microbiol 16:2357-2373
Jendrossek D, Pfeiffer D
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2014. PhaM is the physiological activator of poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) synthase (PhaC1) in Ralstonia eutropha. Appl Environ Microbiol 80:555-563
Pfeiffer D, Jendrossek D
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2015. Comparative proteome analysis reveals four novel polyhydroxybutyrate (PHB) granule-associated proteins in Ralstonia eutropha H16. Appl Environ Microbiol 81:1854-1858
Sznajder A, Pfeiffer D, Jendrossek D
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2015. Formation of Polyphosphate by Polyphosphate kinases and its Relationship to PHB Accumulation in Ralstonia eutropha H16. Appl Environ Microbiol 81:8277-8293
Tumlirsch T, Sznajder A, Jendrossek D
